CHAPITRE 6 - TRANSPORTS ET KINETICS C: MODÈLES DE inhibition de l'enzyme Biochimie - DR. JAKUBOWSKI 12/06/2014 Apprendre buts / objectifs pour le chapitre 6C: Après la classe, en laboratoire. et cette lecture, les étudiants seront en mesure de distinction entre l'inhibition compétitive, non compétitive, et mélangé des enzymes, par inhibiteurs non covalentes réversibles en écrivant couplés équations d'équilibres chimiques et des dessins humoristiques montrant des interactions moléculaires entre, E, S, et je; en utilisant des équations d'équilibres chimiques principe et couplés de Lechatelier, dessiner doubles réciproques (parcelles de Lineweaver-Burk) et parcelles semilog pour enzyme réactions catalysées en présence de différentes concentrations fixes d'inhibiteurs et d'activateurs d'enzyme définir K IS et K II pour l'inhibition compétitive, non compétitive, et mélangé à partir équilibres chimiques couplés et doubles parcelles réciproques; la différence entre les dissociations apparentes et réelles Constantes d'un inhibiteur de l'enzyme et de doubles parcelles réciproques et les équations des équations mathématiques de taux initiaux; définir agoniste, agoniste partiel, antagoniste, et mixtes (antagonistes non) par analogie à des enzymes et leurs inhibiteurs; décrire les différentes façons que les changements de pH pourrait affecter l'activité d'une enzyme et suggérer comment chacun pourrait affecter Km et kcat. Étant donné ce que vous savez déjà sur la structure des protéines, il devrait être facile de comprendre comment inhiber une enzyme. Etant donné que la structure de médiateur fonction, tout ce qui pourrait modifier de manière significative la structure d'une enzyme pourrait inhiber l'activité de l'enzyme. D'où des pH extrêmes et à haute température, qui peuvent tous dénaturer l'enzyme, seraient inhiber l'enzyme de façon irréversible, à moins qu'il puisse replier correctement. Sinon, nous pourrions ajouter une petite molécule qui interagit de façon non covalente avec l'enzyme soit de changer sa conformation ou de prévenir directement la liaison au substrat. Enfin, nous pourrions de manière covalente modifier certaines chaînes latérales, que si elles sont essentielles à l'activité enzymatique, irréversiblement inhiber l'enzyme. COVALENTE INHIBITION Nous avons discuté précédemment, les types de réactifs qui modifieraient chimiquement chaînes latérales spécifiques qui pourraient être critiques pour l'activité enzymatique. Par exemple, l'iodoacétamide peut supprimer l'activité enzymatique si une chaîne latérale de Cys est requise pour l'activité. Ces réactifs seront généralement modifier plusieurs chaînes latérales, cependant, et la détermination de ce qui est essentiel pour la liaison ou de conversion catalytique du substrat peut être difficile. Un moyen serait de protéger le site actif avec une quantité de saturation d'un ligand qui se lie de manière réversible au site actif. Ensuite, la modification chimique peut être réalisée à différents moments de la réaction. La chaîne latérale critique serait protégée de la modification chimique, mais l'étendue de la protection dépendra de la valeur de Kd, de la concentration du ligand protecteur. et la durée de la réaction. TYPES D'INHIBITION non covalentes A. CONCURRENTIEL L'inhibition compétitive se produit lorsque le substrat (S) et de l'inhibiteur (I) se lient tous deux au même site sur l'enzyme. En effet, ils sont en concurrence pour le site actif et se lient d'une manière mutuellement exclusive. Ceci est illustré dans les équations chimiques et des vidéos moléculaire ci-dessous. Il ya un autre type d'inhibition qui donnerait les mêmes données cinétiques. Si S et je liés à différents sites, et S liés à E et produit un changement conformationnel dans E tel que je ne pouvais pas lier (et vice versa), puis la liaison de S et je serais mutuellement exclusives. Ceci est appelé inhibition compétitive allostérique. Les études d'inhibition sont généralement effectuées à plusieurs fixe et les concentrations de I non-saturation et des concentrations variables de S. Les paramètres cinétiques clés pour comprendre sont Vm et Km. Supposons pour la facilité de l'équation dérivation que je lie de façon réversible, et avec équilibre rapide à E, avec une dissociation constante K est. Le & quot; s & quot; dans l'indice & quot; i s & quot; indique que le s lope de la 1 / v vs 1 / S Lineweaver-Burk change tandis que l'ordonnée à l'origine reste constante. K est est également nommé K ic où l'indice & quot; c & quot; synonyme de constante c ompetitive d'inhibition. Un regard sur le mécanisme du haut montre que, même en présence de I, S tend vers l'infini, toutes les E est converti en ES. Autrement dit, il n'y a pas libre E à laquelle je pourrais lier. Maintenant souvenez-vous que Vm = k cat E o. Dans ces conditions, ES = E o; donc v = Vm. Vm ne change pas. Cependant, le Km apparent, Km app. changera. Nous pouvons utiliser le principe de LaChatelier pour comprendre cela. Si je lie à E seul, et non ES, il va déplacer l'équilibre de la E + S & lt; == & gt; ES vers la gauche, ce qui aurait pour effet d'augmenter le Km de l'application (par exemple il semblerait que l'affinité de E et S a diminué.). L'intrigue réciproque double (Lineweaver Burk de la parcelle) offre un excellent moyen de visualiser l'inhibition. En présence de I, Vm ne change pas, mais semble augmenter km. Par conséquent, 1 / Km, l'abscisse à l'origine sur le terrain devient plus petite, et plus proche de 0. Par conséquent les parcelles sera composé d'une série de lignes, avec le même interception y (1 / Vm), et les x intecepts (- 1 / Km) plus près et plus près du 0 comme I augmente. Ces parcelles se croisent sont la marque de l'inhibition compétitive. Notez que dans les trois premiers modèles de l'inhibition abordés dans cette section, les parcelles de Lineweaver-Burk sont linéaires en présence et en absence d'inhibiteur. Ceci suggère que les parcelles de v vs S dans chaque cas serait hyperbolique et se conformer à la forme habituelle de l'équation de Michaelis Menton, chacun avec potentiellement différentes valeurs Vm et Km apparentes. Une équation, représenté sur la figure ci-dessus, peut être dérivée qui montre l'effet de l'inhibiteur compétitif de la vitesse de la réaction. Le seul changement est que le terme Km est multiplié par le facteur 1 + I / Kis. Ainsi Km app = Km (1 + I / Kis). Cela montre que le Km apparent ne augmente comme nous avons prédit. K est la constante de dissociation est inhibiteur dans lequel le nhibitor i affecte le s Lope de l'intrigue réciproque double. Wolfram Mathematica CDF Player - Competitive inhibition v vs S (plugin gratuite nécessaire) 06/04/14 Wolfram Mathematica CDF Player - inhibition compétitive - Lineweaver Burk (plugin gratuite nécessaire) Si les données ont été tracée en vo vs log S, les parcelles seraient sigmoïde, comme nous l'avons vu pour les parcelles de ML vs journal L au chapitre 5B. Dans le cas d'inhibiteur compétitif, l'intrigue de vo vs journal S en présence de différentes concentrations fixes de l'inhibiteur consisterait en une série de courbes sigmoïdes, chacun avec le même Vm, mais avec des valeurs de Km apparentes (où Km app = Km (1 + I / Kis), progressivement décalée vers la droite Enyzme données cinétiques est rarement tracée de cette façon, mais les données simples de liaison pour le M + L. & lt; == & gt; ML équilibre, en présence de différentes concentrations d'inhibiteur est. Reconsidérer notre discussion de l'équilibre de liaison simple, M + L & lt; == & gt; ML. Lorsque nous avons voulu savoir combien est lié, ou la saturation fractionnelle, en fonction du journal L, nous avons considéré trois exemples. L = 0,01 Kd (c.-L & lt; & lt; Kd), ce qui implique que Kd = 100L. Alors Y = L / [Kd + L] = L / [100L + L] ≈ 1/100. Cela implique que, indépendamment de la réelle [L], si L = 0,01 Kd, alors Y ≈ 0,01. L = 100 Kd (à savoir L & gt; & gt; Kd), ce qui implique que Kd = L / 100. Alors Y = L / [Kd + L] = L / [(L / 100) + L] = 100L / 101L ≈ 1. Cela signifie que quelle que soit la réelle [L], si L = 100 Kd, alors Y ≈ 1 . L = Kd, alors Y = 0,5 Ces scénarios montrent que si L varie de plus de 4 ordres de grandeur (0.01Kd & lt; & lt; Kd 100 kD), ou, en termes de journaux, de -2 + Log Kd & lt; log Kd & lt; 2 + log Kd), quelle que soit la grandeur de la valeur de Kd, qui varie d'environ Y 0-1. En d'autres termes, Y varie de 0 à 1 lorsque L varie de log Kd de + 2. Par conséquent, des parcelles de Y vs journal L pour une série de réactions de liaison de plus en plus élevé Kd (faible affinité) pourrait dévoiler une série de courbes identiques sigmoïdales déplacée progressivement vers la droite, comme illustré ci-dessous. La même chose serait vraie de vo vs S dans la présence d'une concentration différente d'un inhibiteur compétitif, pour les flux initial, J o vs ligand extérieur, en présence d'un inhibiteur compétitif, ou ML vs L (ou Y vs L) dans le présence d'un inhibiteur compétitif. Wolfram Mathematica CDF Player - Competitive inhibition v vs journaux (plugin gratuite nécessaire) À bien des égards parcelles de v 0 vs lnS sont plus faciles à interpréter visuellement que les parcelles de v 0 vs S. Comme indiqué pour les parcelles de liaison simples, illustrations de manuels scolaires d'hyperboles sont souvent misdrawn, montrant des courbes de ce niveau trop vite en fonction de [S ] par rapport à des parcelles de v 0 vs lnS, dans laquelle il est facile de voir si la saturation a été atteint. En outre, comme les courbes ci-dessus montrent, plusieurs tracés complets de v 0 vs lnS à divers fixé concentration d'inhibiteur ou de formes variantes de l'enzyme (différentes isoformes, des mutants spécifiques au site) sur une large gamme de lnS peut être faite qui facilite les comparaisons de la cinétiques expérimentales dans ces différentes conditions. Cela est particulièrement vrai si les valeurs de Km diffèrent largement. Maintenant que vous êtes plus familier avec liaison, flux, et les courbes de cinétique enzymatique, en présence et en l'absence d'inhibiteurs, vous devriez être en mesure d'appliquer l'analyse ci-dessus pour les courbes d'inhibition lorsque la liaison, flux initial, ou la vitesse initiale est tracée au concentration variable d'inhibiteur compétitif à différentes concentrations de concentration nonsaturating fixes de ligand ou substrat. Considérons l'activité d'une enzyme. Disons que, à une certaine concentration raisonnable de substrat (pas infini), l'enzyme est d'environ 100% active. Si un inhibiteur compétitif est ajouté, l'activité de l'enzyme chuterait jusqu'à au saturer (infinie) I, aucune activité resterait. Des graphiques montrant ce sont indiqués ci-dessous. Figure: L'inhibition de l'activité enzymatique - Activité% vs journal [inhibiteur] Un cas particulier de l'inhibition compétitive: la constante de spécificité: Dans le chapitre précédent, la constante de spécificité a été défini comme k cat / km, ce qui nous avons aussi décrit comme le deuxième constante de vitesse de commande associée à la réaction bimoléculaire de E et S lorsque S & lt; & lt ; K M. Il décrit également comment une enzyme est bonne dans la différenciation entre les différents substrats. Si l'enzyme a rencontre deux substrats, on peut être considéré comme un inhibiteur compétitif de l'autre. Le calcul ci-dessous montre que le rapport des vitesses initiales de deux substrats opposés à la même concentration est égale au rapport de leurs valeurs de k cat / km. Applet Java: inhibition compétitive I; Inhibition compétitive II B. non compétitives Inhibition compétitive se produit quand je lie uniquement à ES et pas libre E. On peut émettre l'hypothèse que sur la liaison S, un changement conformationnel dans E se produit qui présente un site de liaison pour I. inhibition se produit depuis ESI ne peut pas former un produit. Il est un complexe de morts fin qui n'a qu'un seul destin, pour revenir à ES. Ceci est illustré dans les équations chimiques et des vidéos moléculaire ci-dessous. Supposons pour la facilité de l'équation dérivation que je lie de façon réversible à ES avec une dissociation constante K ii. Le second & quot; i & quot; dans l'indice & quot; i i & quot; indique que le ntecept i du 1 / v vs 1 / S Lineweaver-Burk change tandis que la pente reste constante. K II est également nommé K i u. où l'indice & quot; u & quot; représente le ncompetitive constante d'inhibition de u. Un regard sur le mécanisme du haut montre que la présence de I, S augmente à l'infini, pas tous E est converti en ES. Autrement dit, il ya une quantité limitée d'ESI, même à l'infini S. Maintenant, rappelez-vous que Vm = k cat E o si et seulement si toutes les E est sous la forme ES. Dans ces conditions, l'apparente application Vm, Vm est inférieure à la vraie Vm sans inhibiteur. En outre, le Km apparent, Km app. changera. Nous pouvons utiliser le principe de LaChatelier pour comprendre cela. Si je lie à ES seul, et non E, il va déplacer l'équilibre de la E + S & lt; == & gt; ES vers la droite. ce qui aurait l'effet de la diminution de la Km de l'application (par exemple, il semble que l'affinité de E et S a augmenté.). L'intrigue réciproque double (Lineweaver Burk de la parcelle) offre un excellent moyen de visualiser l'inhibition. En présence de I, à la fois Vm et diminuent km. Par conséquent, -1 / Km, l'abscisse à l'origine sur la parcelle, obtiendra plus négative, et 1 / Vm obtiendra plus positive. Il se trouve que ils changent dans la même mesure. Par conséquent, les parcelles seront constitués d'une série de lignes parallèles, qui est la marque de l'inhibition compétitive. Une équation, illustré dans le schéma ci-dessus, peut être dérivée qui montre l'effet de l'inhibiteur non compétitif de la vitesse de la réaction. Le seul changement est que le terme S dans le dénominateur est multiplié par le facteur 1 + I / Kii. Nous tenons à réorganiser cette équation pour montrer comment Km et Vm sont affectés par l'inhibiteur, pas S, ce qui est évidemment pas. Réorganisation de l'équation, comme indiqué ci-dessus montre que Km app = Km / (1 + I / Kii) et Vm app = Vm / (1 + I / Kii). Cela montre que l'apparente Km et Vm ne diminuent que nous l'avions prévu. K II est la constante de dissociation de l'inhibiteur dans lequel le nhibitor i affecte la ntercept i de la parcelle réciproque double. Notez que si i est nul, Km et Vm sont inchangés. Applet Java: Inhibition non compétitif Wolfram Mathematica CDF Player - non compétitif Inhibition v vs S (plugin gratuite nécessaire) 06/04/14 Wolfram Mathematica CDF Player - inhibition non compétitif - Lineweaver Burk (plugin gratuite nécessaire) C. non compétitif Inhibition non compétitive se produit quand je lie à la fois E et ES. Nous allons regarder seulement le cas particulier où les constantes de dissociation de I pour E et ES sont les mêmes. Ceci est appelé inhibition noncompetiive. Il est assez rare, car il serait difficile d'imaginer un grand inhibiteur qui inhibe le chiffre d'affaires du substrat lié ayant aucun effet sur la liaison de S à E. Cependant interaction covalente de protons avec E et ES peut conduire à l'inhibition non compétitive. Dans le cas le plus général, le KD de sont différents, et l'inhibition est appelé mixte. Depuis l'inhibition se produit, nous allons supposer que ESI ne peut pas former un produit. Il est un complexe de morts fin qui n'a qu'un seul destin, pour revenir à l'assurance-emploi ou ES. Ceci est illustré dans les équations chimiques et dans le dessin ci-dessous moléculaire. Supposons pour la facilité de l'équation dérivation que je lie de façon réversible à E avec une constante de dissociation K est (comme nous l'avons noté une inhibition compétitive) et ES avec une dissociation constante K ii (comme nous l'avons noté pour l'inhibition compétitive). Supposons par inhibition non compétitive que Kis = Kii. Un regard sur le mécanisme du haut montre que la présence de I, S augmente à l'infini, pas tous E est converti en ES. Autrement dit, il ya une quantité limitée d'ESI, même à l'infini S. Maintenant, rappelez-vous que Vm = k cat E o si et seulement si toutes les E est sous la forme ES. Dans ces conditions, l'apparente application Vm, Vm est inférieure à la vraie Vm sans inhibiteur. En revanche, le ressort km, km application. ne changera pas puisque je lie à la fois E et ES avec la même affinité, et par conséquent ne sera pas perturber cet équilibre, déduit d'après le principe de LaChatelier. L'intrigue réciproque double (Lineweaver Burk de la parcelle) offre un excellent moyen de visualiser l'inhibition. En présence de I, juste Vm va diminuer. Par conséquent, -1 / Km, l'abscisse à l'origine restera le même, et 1 / Vm obtiendra plus positive. Par conséquent, les parcelles sera composé d'une série de lignes qui se croisent sur l'axe des x, qui est la marque de l'inhibition non compétitive. Vous devriez être en mesure de comprendre comment les parcelles semblent si Kis est différente de Kii (inhibition mixte). Une équation, représenté sur le schéma ci-dessus peut être dérivée qui montre l'effet de l'inhibiteur non compétitif de la vitesse de la réaction. Au dénominateur, Km est multipliée par 1 + I / Kis, et S par 1 + I / Kii. Nous tenons à réorganiser cette équation pour montrer comment Km et Vm sont affectés par l'inhibiteur, pas S, ce qui est évidemment pas. Réorganisation de l'équation, comme indiqué ci-dessus montre que Km app = Km (1 + I / Kis) / (1 + I / Kii) = Km quand Kis = Kii, et Vm app = Vm / (1 + I / Kii). Cela montre que le Km et Vm est inchangé diminue à mesure que nous avons prédit. Le graphique montre une série de lignes qui se croisent sur l'axe des x. Tant la pente et l'ordonnée à l'origine sont modifiées, qui sont reflétés dans les noms des deux constantes de dissociation, K et K est ii. Notez que si i est nul, Km app = Km et Vm app = Vm. Parfois, les Kis et Kii dissociations d'inhibition constantes sont appelées Kc et Ku (constantes inhibition dissociation compétitifs et non compétitifs. Mixte (et non) l'inhibition compétitive (comme indiqué par le mécanisme ci-dessus) diffèrent d'inhibition compétitive et uncompetiive en ce que la liaison de l'inhibiteur est pas simplement une réaction de l'impasse dans laquelle l'inhibiteur ne peut dissocier dans une étape inverse unique. Dans l'équilibre ci-dessus, S peut dissocier de ESI pour former l'assurance-emploi afin que le système ne peut pas être à l'équilibre. Avec mortes étapes d'extrémité, aucun flux de réactifs se produit à travers les morts complexe d'extrémité de sorte que le équilibre pour l'étape d'impasse est pas perturbée. D'autres mécanismes peuvent souvent donner inhibition mixte. Par exemple, le produit libéré dans un mécanisme de ping-pong (discuté dans le chapitre suivant) peut donner inhibition mixte. Si P, agissant comme un inhibiteur de produit, peut se lier à deux formes différentes de l'enzyme (E 'et E aussi), il agira comme un inhibiteur mixte. Applet Java: inhibition non compétitive 26/04/13 Wolfram Mathematica CDF Player - Mixte Inhibition v vs courbes en S; Kis et Kii appelés Kc et Ku (commencer curseurs à des valeurs élevées) (plugin gratuite nécessaire) 26/04/13 Wolfram Mathematica CDF Player - Mixte Inhibition v vs courbes en S (commencer curseurs à des valeurs élevées) (plugin gratuite nécessaire). Remarque où les courbes se croisent inhibés et inhibés à différentes valeurs de Kis et Kii (dans le graphique appelé Kc et Ku). Si vous pouvez appliquer le principe de LeChatilier, vous devriez être en mesure de tirer les parcelles de Lineweaver-Burk pour tout scénario de l'inhibition ou même le cas contraire, l'activation de l'enzyme! Inhibition de l'enzyme IN VITRO L'ensemble industriel pharmaceutique est consacrée à trouver des molécules de médicaments qui affectent les processus biologiques. Habituellement, cela signifie le développement de petites molécules inhibitrices de protéines cibles, bien que des travaux récents ont élargi au développement de molécules d'ARN inhibitrices qui affectent la transcription de l'ADN et la traduction des ARNm. En utilisant des techniques de synthèse combinatoire et la modélisation informatique, on a obtenu plus facile à développer inhibiteurs à petites molécules (en particulier ceux de compétition) qui inhibent les protéines in vitro en utilisant des enzymes purifiées, des substrats et des inhibiteurs dans les tests de laboratoire. En supposant que l'inhibiteur pourrait passer à travers la membrane et d'accumuler à une concentration suffisante, aurait-il les mêmes propriétés inhibitrices dans la cellule comme dans le tube à essai? La réponse se révèle être peut-être. Rappelez-vous que la cellule est étroitement emballé avec une multitude d'autres petites molécules et des macromolécules. En outre, l'enzyme cible de l'inhibition est très probablement en partie d'une voie d'enzymes qui alimente réactif dans l'enzyme et supprime le produit. D'où le flux de substrat et le produit est commandé par l'ensemble de filière et non pas seulement l'enzyme cible unique bien que la concentration de la production de l'enzyme cible est déterminée par des paramètres cinétiques de l'enzyme et la concentration du substrat disponible. Les conditions dans lesquelles les enzymes sont étudiés (in vitro) et exploitent (in vivo) sont très différents. In vitro (en laboratoire), l'enzyme est maintenue à une concentration constante pendant que le substrat est modifiée (par exemple la concentration en substrat est la variable indépendante). La vitesse est déterminée par la concentration de substrat. Quand on étudie l'inhibition, le substrat est modifiée tandis que l'inhibiteur est maintenu constant à plusieurs concentrations différentes fixes. In vivo (dans la cellule), la vitesse peut être maintenue à un niveau relativement fixe avec le substrat déterminée par la vitesse. Pour éviter un goulot d'étranglement dans le flux, substrat ne peut pas construire à l'enzyme, de sorte que l'enzyme traite dans un mode d'état stable pour produire un produit tel que déterminé par l'équation Michael-Menten. Ce qui arrive quand un inhibiteur est ajouté in vivo. Supposons que l'enzyme fonctionne à v = Vm / 2. Nous avons vu avant pour l'inhibition in vitro qu'il est parfois difficile de différencier une inhibition compétitive et uncompetiive (comme en témoignent de réels parfaits parcelles réciproques doubles non hypothétique). Comment in vivo parcelles d'inhibition pourrait ressembler à une vitesse constante (par exemple v = Vm / 2) lorsque les deux I et S peuvent varier et dans laquelle S pour une enzyme dans le milieu d'une voie est déterminé par v? Les équations et graphique ci-dessous montre le ratio de S / Km vs je ix / K pour l'inhibition constants v, une condition rencontrés lors d'une enzyme dans une des voies métaboliques est soumis au flux contrôles imposés par l'ensemble du parcours. L'axe des x reflète la quantité relative de l'inhibiteur par rapport à sa constante d'inhibition. De même, l'axe y reflète la quantité relative du substrat par rapport à son kilomètres. Le graphique de l'inhibition compétitive in vivo est linéaire, mais il & quot; explose & quot; pour l'inhibition compétitive. Figure: Inhibition compétitive et non compétitif in vivo Inhibition compétitive au Contant v